穩(wěn)定性同位素標記的糖代謝研究

Ron Orlando

復雜碳水化合物研究中心，生物化學和分子生物學系，化學系，喬治亞大學，雅典，GA 30602 USA

 

“我的實驗室已經(jīng)使用了一系列的CIL產(chǎn)品，他們的產(chǎn)品在蛋白組學和糖組學定性定量的表現(xiàn)很滿意。

CIL的銷售人員非常樂于助人并且知識淵博，他們多次在實驗設計上幫助我們，如果沒有他們的幫助我們無法完成這項研究工作?！?/span>--– Ron Orlando

 

 

糖基化是真核系統(tǒng)中最常見的蛋白質表達修飾之一。據(jù)估計60-90%的哺乳動物蛋白是糖基化的，事實上所有膜和分泌蛋白也是糖基化的。糖蛋白在生理代謝中通常起關鍵作用，例如細胞識別，信號傳導，炎癥和癌變。鑒于蛋白質糖基化的重要生理作用，眾多研究團隊致力于特異性聚糖的結構鑒定，表達蛋白的聚糖，以及對這些結構如何變化的詳細研究，例如細胞分化或隨著腫瘤細胞的發(fā)展。所有這些努力發(fā)展出了新的研究領域--糖組學。

質譜（MS）已經(jīng)發(fā)展成為一種分析復雜混合物的方法，以其快速、靈敏、準確而廣受歡迎。糖組學研究通常包括質譜分析（MS）聚糖的徹底分解產(chǎn)物。雖然對聚糖進行定性這是一個有效方法，但是在MS定量上存在爭議。例如,基質效應，由于其他化合物的存在對分析電離物的離子抑制現(xiàn)象，能夠在底物濃度不變的情況下影響指定物質的分析結果。其他干擾質譜分析結果的因素包括不同儀器的檢出限，以及儀器存在的誤差，和樣品處理過程中的損失。不同相對定量方法的成功運用取決于如何解決原始數(shù)據(jù)存在的誤差。

同位素標記技術的使用可以彌補這些定量的缺陷，因此在各種“組學”中得到了廣泛的應用，其中在蛋白質組學領域應用最廣泛。穩(wěn)定同位素標記的氨基酸在細胞培養(yǎng)（SILAC）方面就是一個很好的例子，該方法完美的將同位素標記與蛋白質結合，以便用質譜來研究蛋白質組學。在SILAC實驗中，兩種細胞生長在培養(yǎng)基中，其中一個有“輕氨基酸”（自然豐度），另一個是重氨基酸（同位素標記）（例如，未標記和L-賴氨酸·2HCl（13C6，99%）（CIL目錄號CLM-2247）和L-精氨酸·HCl（13C6，99%）（CIL目錄號CLM2265））。同位素標記的氨基酸代替了細胞培養(yǎng)中使用的天然氨基酸與所有新和成的蛋白質結合。在細胞分裂過程中，每一個特定的氨基酸都被對應的同位素標記氨基酸替代。這種方法的優(yōu)勢是兩種細胞裂解后立即混合在一起，因此來自這兩種細胞類型的蛋白質在相同的樣品處理過程中的消化、純化和分離步驟的實驗條件完全相同。 因為這個原因，SILAC通常被認為是蛋白質組學定量的金標準。

在這篇文章中描述了糖組學的一種體內標記的方法，這種方法類似于SILAC在蛋白質組學領域的應用。這種糖組學方法叫做IDAWG -（谷氨酰胺對氨基糖的同位素檢測）-這基于谷氨酰胺側鏈是氨基糖核苷酸合成中唯一的氮供體（圖一）。因此，將L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）引入不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，可產(chǎn)生N15標記的包括乙酰氨基葡萄糖、乙酰半乳糖胺和唾液酸在內的所有氨基糖類。這導致每個含N和O的聚糖、糖脂和胞外基質多糖的質量數(shù)增加+1Da。該方法通過培養(yǎng)在未標記和N15標記的谷氨酰胺環(huán)境中的小鼠胚胎干細胞蛋白質釋放含N聚糖的實驗得到了驗證。這些實驗的成功使我們預測，未來IDAWG技術將有助于細胞培養(yǎng)方面各種比較糖組學的研究。

 

 

圖1：己糖胺生物合成途徑表明谷氨酰胺的側鏈是糖核苷酸產(chǎn)生過程中氨

基糖的唯一氮供體來源，這允許將15N同位素標記引入所有氨基糖，包括

GlcNAc、GalNAc和唾液酸。含15N的物質用藍色表示。

 

結論

己糖胺生物合成途徑的第一步也是限速步驟（圖1）是糖酵解中間產(chǎn)物的轉化（果糖-6-磷酸轉化為葡萄糖胺-6-磷酸）。在這個步驟中引入的氨基氮僅由Gln（谷氨酰胺）的側鏈酰胺提供，它被轉化為Glu（葡萄糖）。葡萄糖胺-6-磷酸是UDP-GlcNAc的前體，UDP-GlcNAc又導致其他主要的含糖核苷酸氨基糖UDPGalNAc和CMP-唾液酸。因此，所有含有GlcNAc-、GalNAc-和唾液酸的分子都是通過在細胞培養(yǎng)基中添加酰胺-15N-Gln來進行同位素標記的靶點。

 

 

 

圖2。同位素標記的N-連接聚糖。全FT-MS 850-2000m/z二甲基化N-鏈的光譜在未

標記的Gln中生長的細胞釋放的聚糖（2A）或酰胺-15N-Gln（2B）。光譜的擴展區(qū)域

顯示15N的預期2 Da質量位移進入GlcNAc2Man7的兩個核心GlcNAc殘基聚糖（2C，

2D）和5-Da增加對應于15N摻入羊膜五糖中GlcNAc5Man3Gal2Fuc3聚糖（2E，2F）。

 

初步實驗，評估使用代謝標記方法將穩(wěn)定同位素植入培養(yǎng)細胞的聚糖中的可能性。

在這些實驗中，R1小鼠胚胎干細胞（mESCs）是在標準條件下培養(yǎng)的。細胞培養(yǎng)基通常不含谷氨酰胺，

因為這種氨基酸在水溶液中分解為谷氨酸和氨。這種方式簡化了IDAWG標記方法，因為不需要特別消耗Gln（谷氨酰胺）培養(yǎng)基。使用15N標記的-Gln或未標記的Gln以標準濃度（2 mM）補充培養(yǎng)基。這種直接的替代是唯一改變正常細胞培養(yǎng)程序所需的IDAWG。在這個例子中，小鼠胚胎干細胞用標記或未標記Gln培養(yǎng)三天，然后從蛋白質中分離出N-和O-連接的聚糖，用于質譜分析。通過比較在未標記的Gln或L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）中生長的細胞釋放的過甲基化N-連接聚糖的FT-MS（超高分辨光譜）光譜，研究了15N并入MESC的N-連接聚糖中的情況（圖2A和2B）。在這些光譜中觀察到的豐富離子對應于單電荷或雙電荷的高甘露糖聚糖（GlcNAc2Man5-9）。通過這兩種光譜的對比表明，在重介質中生長的細胞獲得的聚糖離子，雙電荷離子增加了1 m/z單位，單電荷離子增加了2 m/z單位。這個預期的結果，前提是15N已并入這些聚糖中所含的兩個核心GlcNAC，并且這是高甘露糖聚糖中唯一的氮。

在仔細觀察雙電荷分子離子（M+2Na）2+時，可以清楚地看到聚糖質量的這種變化，這種雙電荷分子離子是由GlcNAc2Man7聚糖產(chǎn)生的，它分別以1005.5和1006.5 M/z單位出現(xiàn)在14N和酰胺-15N的聚糖中（圖2C和2D）。在這些光譜中，響應最強的離子出現(xiàn)在用14N或兩個15N計算的單同位素質量處，這表明這種聚糖的大多數(shù)都有15N結合到兩個可能的位點。存在與標記不足相對應的離子，即零和一個15N的結合；然而響應最強的是完全標記的。

大量的N-連接聚糖通過每個GlcNAc端基插入一個15N而質量相似地增加。這可以通過擴展圖2A和2B中所示的光譜來觀察，以便僅觀察到從960.5到964.1的區(qū)域（圖2E和2F，分別針對在14N和酰胺15N Gln培養(yǎng)基中生長的細胞釋放的聚糖。該區(qū)域顯示了分子離子，（M+3Na）3+，用于組成GlcNAc5Man3Gal2Fuc3的復雜聚糖。正如所預測的，當從生長在15N-Gln中的細胞中獲得該聚糖時，其單同位素離子增加了+5Da。此外，完全標記的聚糖是主要存在形式，然而不完全標記的，卻能從標記不完全處觀察到離子。

通過計算15N光譜強度的不同同位素，表明該聚糖中含有98%的15N，恰好等于這個實驗所用谷氨酰胺中15N的量。對其他聚糖的同位素分布的類似計算表明，它們的15N摻入范圍為96-98%。這些實例表明，L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）中的15N被廣泛地并入N-連接聚糖的GlcNAc端基，表明這可能是將穩(wěn)定同位素引入聚糖的有效方法。

討論

聚糖的代謝標記為評估在培養(yǎng)中誘導或維持的任何細胞行為過程中聚糖轉換的動力學提供了許多新的機會。例如，用L-谷氨酰胺（酰胺-15N，98%）標記細胞，然后用輕Gln代替培養(yǎng)基補充劑，可以測定任何含氨基糖聚糖的半衰期。以前，聚糖轉化研究需要結合放射性單糖和廣泛的后續(xù)分餾，以確定聚糖表達的具體變化。一般來說，這些放射性示蹤技術能夠非常靈敏的檢測聚糖類物質，但在跟蹤個別聚糖結構或亞群的生物合成相關物質上分辨率低。本文報道的穩(wěn)定同位素摻入法將高分辨率質譜的分析優(yōu)勢與理解聚糖轉化動力學的生物學必要性結合起來。因此，IDAWG呈現(xiàn)出一種有效的定量方法，探索聚糖、糖蛋白和糖脂在細胞培養(yǎng)系統(tǒng)中的生物學作用。

感謝

本研究由美國國立衛(wèi)生研究院/NCRR資助的生物醫(yī)學糖組學綜合技術資源（P41 RR018502）和美國國立衛(wèi)生研究院/NCRR資助的綜合糖技術研究資源（P41 RR005351）資助。

SILAC相關產(chǎn)品

貨號	品名	貨號	品名
CLM-2265	L-Arginine·HCl (13C6, 99%)	DLM-4212	L-LEUCINE (ISOPROPYL-D7, 98%)
NLM-557	L-Glutamine (amide-15N, 98%)	CLM-653	L-LYSINE:2HCL (1-13C, 99%)
CLM-2247	L-Lysine·2HCl (13C6, 99%)	CLM-653	L-LYSINE:2HCL (1-13C, 99%) MICROBIOLOGICAL/PYROGEN TESTED
DLM-6038	L-ARGININE:HCL  (4,4,5,5-D4, 94%)	CNLM-7821	L-LYSINE:2HCL (1-13C, 99%; ALPHA-15N, 98%)
NLM-395	L-ARGININE:HCL MICROBIOLOGICAL（15N2,98%+)	CDNLM-6810	L-LYSINE:2HCL (13C6, 97-99%; D9, 97-99%; 15N2, 97-99%)
CLM-2051	L-ARGININE:HCL (1,2-13C2, 99%)	CNLM-291	L-LYSINE:2HCL (13C6, 99%; 15N2, 99%)
CLM-1268	L-ARGININE:HCL (1-13C, 99%)	NLM-1554	L-LYSINE:2HCL (15N2, 98%+)
CNLM-7819	L-ARGININE:HCL(1-13C,99%;ALPHA-15N,98%)	DLM-2641	L-LYSINE:2HCL (3,3,4,4,5,5,6,6-D8, 98%)
CDNLM-6801	L-ARGININE:HCL (13C6, 97-99%; D7, 97-99%; 15N4, 97-99%)	DLM-2640	L-LYSINE:2HCL (4,4,5,5-D4, 96-98%)
CNLM-539	L-ARGININE:HCL (13C6, 99%; 15N4, 99%)	DLM-2640	L-LYSINE:2HCL (4,4,5,5-D4, 96-98%)MICROBIOLOGICAL/PYROGEN TESTED
NLM-396	L-ARGININE:HCL (15N4, 98%)	CLM-632	L-LYSINE:2HCL (6-13C, 99%)
NLM-1267	L-ARGININE:HCL (ALPHA-15N, 98%+)	CNLM-3454	L-LYSINE:2HCL (6-13C, 99%; EPSILON-15N, 98%)
DLM-541	L-ARGININE:HCL (D7, 98%)	NLM-143	L-LYSINE:2HCL (ALPHA-15N, 98%)
DNLM-7543	L-ARGININE:HCL (D7, 98%; 15N4, 98%)	NLM-143	L-LYSINE:2HCL (ALPHA-15N, 98%) MICROBIOLOGICAL/PYROGEN TESTED
CLM-2070	L-ARGININE:HCL (GUANIDO-13C, 99%)	DLM-570	L-LYSINE:2HCL (D9, 98%)
NLM-395	L-ARGININE:HCL (GUANIDO-15N2, 98%+)	DNLM-7545	L-LYSINE:2HCL (D9, 98%; 15N2, 98%)
ULM-8347	L-ARGININE:HCL UNLABELED	NLM-631	L-LYSINE:2HCL (EPSILON-15N, 98%+)
CLM-2262	L-LEUCINE (13C6, 99%)	ULM-8766	L-LYSINE:2HCL UNLABELED
CLM-2262	L-LEUCINE (13C6, 99%) MICROBIOLOGICAL/PYROGEN TESTED
CNLM-281	L-LEUCINE (13C6, 99%; 15N, 99%)

 

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